磷脂酰絲氨酸合成酶（PSS）基因負(fù)責(zé)合成磷脂酰絲氨酸（PS），而磷脂酰絲氨酸作為真核生物膜關(guān)鍵的帶負(fù)電甘油磷脂，在細(xì)胞凋亡、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)等諸多生理過(guò)程中作用關(guān)鍵。CRISPR/Cas9技術(shù)憑借精準(zhǔn)、高效的基因編輯優(yōu)勢(shì)，常通過(guò)基因敲除、定點(diǎn)突變、過(guò)表達(dá)等策略驗(yàn)證該基因功能，目前已在植物、哺乳動(dòng)物、微生物等不同研究對(duì)象中取得諸多成果，以下是具體的研究思路和相關(guān)實(shí)例解析：

基因敲除策略：驗(yàn)證基因核心生理功能

該策略通過(guò)CRISPR/Cas9敲除目標(biāo)生物的磷脂酰絲氨酸合成酶基因，對(duì)比敲除株與野生株在磷脂酰絲氨酸含量、細(xì)胞生理狀態(tài)及特定表型上的差異，明確基因的基礎(chǔ)功能。

植物領(lǐng)域：中國(guó)科學(xué)院植物研究所團(tuán)隊(duì)針對(duì)鹽生植物鹽角草，構(gòu)建了其磷脂酰絲氨酸合成酶基因（SePSS）的CRISPR/Cas9基因打靶載體，并在鹽角草愈傷組織中表達(dá)。結(jié)果顯示，基因打靶后的鹽角草細(xì)胞靶位點(diǎn)出現(xiàn)不同程度突變，磷脂酰絲氨酸的含量顯著降低，細(xì)胞質(zhì)膜在高鹽環(huán)境下發(fā)生明顯去極化，且在200mM NaCl處理下表現(xiàn)出敏鹽現(xiàn)象；而野生型和過(guò)表達(dá)SePSS的細(xì)胞系則能維持膜極性和耐鹽性，以此證實(shí) SePSS通過(guò)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)膜極化參與鹽角草的適鹽反應(yīng)。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞領(lǐng)域：研究人員在人類SV589細(xì)胞中通過(guò)CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)，敲除磷脂酰絲氨酸合成酶1基因（PTDSS1）后，細(xì)胞內(nèi)磷脂酰絲氨酸含量下降。此時(shí)低密度脂蛋白（LDL）來(lái)源的膽固醇雖能離開(kāi)溶酶體，但無(wú)法正常轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，轉(zhuǎn)而在質(zhì)膜積累；而外施磷脂酰絲氨酸可恢復(fù)膽固醇向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)。這一結(jié)果證明PTDSS1合成的磷脂酰絲氨酸是膽固醇從質(zhì)膜向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵調(diào)控因子，保障細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)。

定點(diǎn)突變策略：解析基因關(guān)鍵功能位點(diǎn)

該策略借助CRISPR/Cas9對(duì)磷脂酰絲氨酸合成酶基因的特定堿基進(jìn)行編輯，實(shí)現(xiàn)酶活性中心或底物結(jié)合位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，進(jìn)而明確基因中關(guān)鍵氨基酸殘基的作用，深入探究酶的催化機(jī)制。李曉淳團(tuán)隊(duì)在人類PSS1基因的研究中便采用了此方式：一方面，通過(guò)CRISPR技術(shù)構(gòu)建了PSS1P269S功能獲得性突變體，實(shí)驗(yàn)證實(shí)該突變體相較于野生型PSS1，催化合成磷脂酰絲氨酸的活性更強(qiáng)，而這種突變會(huì)導(dǎo)致Lenz-Majewsk綜合征；另一方面，針對(duì)PSS1催化中心的組氨酸H172構(gòu)建了H172A突變體，發(fā)現(xiàn)該突變體幾乎喪失催化活性，同時(shí)若苯丙氨酸F168等底物結(jié)合相關(guān)殘基發(fā)生突變，酶活性也會(huì)顯著受抑，這些結(jié)果明確了H172是PSS1催化磷脂酰絲氨酸合成的核心位點(diǎn)，而F168等殘基對(duì)底物結(jié)合至關(guān)重要。

基因過(guò)表達(dá)策略：強(qiáng)化基因功能關(guān)聯(lián)性驗(yàn)證

該策略通過(guò)CRISPR介導(dǎo)的基因定點(diǎn)整合，將磷脂酰絲氨酸合成酶基因插入細(xì)胞基因組的高表達(dá)區(qū)域，使基因過(guò)量表達(dá)，觀察磷脂酰絲氨酸合成及下游生理過(guò)程的強(qiáng)化效應(yīng)，進(jìn)一步佐證基因功能。例如在鹽角草的研究中，研究人員通過(guò)CRISPR相關(guān)的載體構(gòu)建實(shí)現(xiàn)SePSS基因的過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)細(xì)胞系中SePSS轉(zhuǎn)錄本數(shù)量顯著上升，磷脂酰絲氨酸的含量同步增加，鹽角草在高鹽環(huán)境下保持細(xì)胞質(zhì)膜極性的能力顯著增強(qiáng)，耐鹽性提升，與基因敲除株的敏鹽表型形成鮮明對(duì)比，從正反兩方面驗(yàn)證了SePSS對(duì)植物耐鹽性的調(diào)控作用。此外，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)PTDSS1可促進(jìn)磷脂酰絲氨酸合成，進(jìn)而增強(qiáng)膽固醇向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，緩解膽固醇在質(zhì)膜的異常積累，進(jìn)一步印證其在膽固醇代謝中的調(diào)控功能。

多重編輯策略：探究基因家族的協(xié)同作用

部分生物中存在多種磷脂酰絲氨酸合成酶同源基因，如哺乳動(dòng)物的PTDSS1和PTDSS2，利用CRISPR技術(shù)可同時(shí)對(duì)多個(gè)同源基因進(jìn)行編輯，探究它們的功能冗余或特異性。研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除小鼠的PTDSS1或PTDSS2基因，小鼠均可存活，這表明兩者在功能上存在一定冗余；但同時(shí)敲除這兩個(gè)基因則會(huì)導(dǎo)致小鼠致死，該結(jié)果說(shuō)明這兩個(gè)基因共同介導(dǎo)磷脂酰絲氨酸合成，是維持小鼠生命活動(dòng)不可或缺的關(guān)鍵基因，且無(wú)法被彼此完全替代，為解析基因家族的協(xié)同作用提供了直接證據(jù)。

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